产品描述

SYBR Green I是一种结合于双链DNA(double-strand DNA, dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱，一旦与双链DNA结合后，其荧光会大大增强。通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。

Quant TaqTM qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox)是 2×实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix 中含有热启动DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及Low Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量 PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

本品采用的DNA 聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性 PCR 扩增的因子和提升PCR 反应扩增效率的因子，使定量 PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

适用机型

使用No ROX 仪器机型

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; MiniOpticon™,

Cepheid SmartCycler®;

Eppendorf Mastercycler® eprealplex, realplex 2s;

Illumina Eco™ qPCR;

Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000;

Roche: LightCycler® 480, 96, Nano, 1.5/2.0**;

Thermo Scientific PikoReal Cycler.

使用Low ROX仪器机型

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA™7,

QuantStudio 6 and 7 Flex System, QuantStudio 3 and 5;

Agilent Stratagene: MX4000™, MX3005P™, MX3000P™.

使用High ROX仪器机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOne Plus™.

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期 18 个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料 SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1、. 解冻后Master Mix 可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

2.、为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

反应体系（推荐冰上配制）

使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

引物浓度：通常引物终浓度为 0.2 μM，也可以根据情况在

0.1-1.0 μM 之间进行调整。

模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。

模板稀释：cDNA 原液建议 5-10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 CT 值在 20-30 个循环为好。

反应体系：推荐使用 20μl 或 50μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

组分体积（ μl ）体积（ μl ）终浓度
Quant Taq TM qPCR SYBR Green Master Mix ( L o w Rox)	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.4	1	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.4	1	0.2 μM
模板 DNA	X	X	-
无菌超纯水	to 20	to 50	-

a） 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至 2 min。

b）退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c）荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec 以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad:

CFX96

31sec 以上：Applied Biosystems: 7300

34sec 以上：Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

常见问题及改进

问题	可能的原因	建议改进	问题	可能的原因	建议改进
阴性对照中出现明显的扩增结果	所使用的试剂或去离子水被污染	更换新的试剂及去离子水并保证在洁净的实验台上进行试验	无扩增曲线	循环数不足	循环数一般设为40
阴性对照中出现明显的扩增结果	引物二聚体	35个循环之后阴性对照出现明显扩增是正常的，应该结合溶解曲线进行分析		循环程序中不存在信号收集程序	两步法中信号收集是设定在退火和延伸步骤；三步法中信号收集应该设定在72℃延伸步骤
Ct值明显过高或过低	低扩增效率	优化反应体系，尝试三步法或重新设计引物		引物降解	长期储存后应该通过PAGE胶确定引物的完整性
	模板浓度太低	增大模板浓度		引物降解	长期储存后应该通过PAGE胶确定引物的完整性
	模板发生降解	制备新鲜的模板		模板浓度太低	降低稀释比（对于未知表达情况的目的基因，首次检测采用模板原液）
	扩增片段太长	扩增片段的长度建议为100- 200 bp		模板浓度太低	降低稀释比（对于未知表达情况的目的基因，首次检测采用模板原液）
	反应体系中存在PCR 抑制物	抑制物往往由于模板的加入而引入，可以稀释模板或者重新制备模板		模板降解	制备新鲜模板
扩增曲线形状异常	扩增曲线形状异常	信号较弱时系统的校正会导致此结果，可以通过提高模板浓度改进	溶解曲线杂峰	引物设计不合理	引物二聚体的杂峰常出现在75℃ 左右，如该峰值显著，需要重新设计引物
	扩增曲线形状异常	信号较弱时系统的校正会导致此结果，可以通过提高模板浓度改进		引物浓度过高	适当降低引物浓度
	断裂或下降的扩增曲线	模板浓度太高，基线的终点值高于Ct 值，可以减小基线的终点值（Ct值- 4）并且重新分析数据		模板浓度过低	适当增加模板浓度
	断裂或下降的扩增曲线	模板浓度太高，基线的终点值高于Ct 值，可以减小基线的终点值（Ct值- 4）并且重新分析数据		基因组DNA污染	跨内含子设计引物
	扩增曲线突然下降	反应体系中存在气泡并且在温度升高的时候突然破掉，设备会探测到突然的荧光值下降，可以离心并检查是否存在气泡	复孔稳定性差	加样误差	增大反应体系；增加模板稀释倍数，同时提高加样体积
				模板浓度过低	提高加样量
				仪器问题	仪器各孔之间温度有差异，需校准仪器后使用