产品描述

ABScript III One Step RT-qPCR Probe Kit with UDG V5 是采用探针法进行 RT-qPCR 反应的通用款试剂盒。本试剂盒以 RNA为模板，使用基因特异引物，逆转录和 PCR 反应可在同一管内连续进行，不需要额外的开管、移液等操作，大大提高了检测通量。本试剂盒引入 dUTP/UDG 防污体系，热敏感 UDG 在室温下就可将含 U 的污染物迅速降解，50℃逆转录时热敏 UDG 迅速失活，不会影响 RT-qPCR 的效率和灵敏度。本反应体系可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并且省略了 PCR 反应后的电泳步骤，非常适合于 RNA 病毒等微量 RNA 的检测。本制品使用适合 RT-qPCR 的新型逆转录酶 ABScript III ReverseTranscriptase 高效合成第一链 cDNA，搭配使用探针和 TaqDNA Polymerase，配合经过优化的缓冲体系，具有高扩增效率和高扩增灵敏性，能稳定高效的进行一步法 RT-qPCR 反应。

适用机型

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期 18 个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料 SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1、. 解冻后Master Mix 可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

2. 、为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

反应体系（推荐冰上配制）

【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a）引物浓度：通常引物终浓度为 0.2μM，也可以根据情况在 0.2-1.0 μM 之间进行调整。

b）模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。

c）模板稀释：cDNA 原液建议 5-10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 CT 值在 20-30 个循环为好。

d）反应体系：推荐使用 20μl 或 50μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e）体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

扩增程序（两步法）

【注】： 延伸时间根据qPCR仪所需数据采集时间自行调整：使用StepOnePlus请设定为30s，使用7300请设定为31s，使用7500请设定为34s。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S 型。

Ct 值落在 20-30 之间时，定量分析最准确；

Ct 值小于 10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct 值介于 30-35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。熔解曲线出现双峰，需要通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

引物设计指南

1.、 推荐引物长度 25 bp 左右。扩增产物长度 150 bp 为佳，可以在 100 bp-300 bp 内选择。

2.、 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过 2℃。引物 Tm 值 60℃-65℃为佳。

3、. 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的 4 个相同碱基，GC 含量控制在 50%左右。3’端最后一个碱基最好为 G 或 C。

4、. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有 3 个碱基以上的互补序列。

5、. 引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物 3’端有 2 个碱基以上的非特异性互补。

6、. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。